Bakteriální bioluminiscenční test toxicity (BBTT) – LUMIStox

Řasa

Výše uvedené nedostatky bakteriální bioluminiscenční test toxicity nemá. Test se běžně masově používá pro stanovení akutní toxicity různých látek ve vyspělých průmyslových zemích, především v Německu, Holandsku, Švýcarsku, Kanadě, Francii, a dalších zemích.
Toxikologická laboratoř využívající BBTT pracuje s vysokou efektivitou. Eliminace pracnosti spojené s chovem indikátorových organismů a objektivita výsledků daná přesným elektronickým odečtem světelné intenzity produkované bioluminiscencí umožňuje dosahovat rychle velkého množství výsledků s vysokou kvalitou. Test BBTT trvá podle druhu pouze několik minut (screning) , nebo několik desítek minut pro stanovení efektivní koncentrace, případně hodnot limitního zředění.

Princip

Vibrio Fischeri

Procedura je založena na schopnosti mořských světélkujících baktérií reagovat změnou bioluminiscence na přítomnost xenobiotik v jejich okolí. Luminiscenční baktérie, které výrobce dodává v dehydratovaném stavu zaručujícím dostatečnou reziduální bioluminiscenci, se až do stanovení toxicity uchovávají v chladu a rehydratují se teprve těsně před použitím. Po resuscitaci se se suspenzí pracuje jako s obyčejnou chemikálií, žádná speciální biologická erudice není nutná.

V luminometru (luminiscenčním fotometru) se nejprve změří výchozí bioluminiscence bakteriální suspenze v nepřítomnosti cizorodých látek, pak se přidá testovaná látka v několika koncentracích (normálně se přidává 0,5 ml roztoku s toxikantem k 0,5 ml bakteriální kultury), směsi se určitou dobu (5–30 min) inkubují a nakonec se změří výsledná hodnota bioluminiscence. Čím je testovaná látka toxičtější resp. čím vyšší je koncentrace toxikantů ve vzorku, tím je pokles bioluminiscence výraznější. Jako referenční roztok (blank) se používá netoxický solvent (2% NaCl), v němž je testovaná látka rozpuštěna. Koncentraci chloridu sodného je třeba dodržet, luminiscenční baktérie jako mořské mikroorganismy by při nižší osmolaritě zlyzovaly. Protože bioluminiscence jako enzymový proces závisí na teplotě, provádí se inkubace s toxikantem i měření v temperovaném prostředí, obvykle při +15°C (stanovených normou). Z naměřených hodnot bioluminiscence v přítomnosti a nepřítomnosti toxikantu se sestrojí dávková křivka, z níž se vypočítá nebo graficky odečte efektivní koncentrace toxikantu, tj. taková koncentrace, která vyvolává zvolený pokles bioluminiscence (např. EC50 pro 50% inhibici produkce světla). Syfistikovaný luminometr LUMIStox provádí samozřejmě výpočzy automaticky.

Vybavení

Základním přístrojem pro provádění bioluminiscenčního bakteriálního testu toxicity (BBTT) je temperovaný analytický luminometr, tj. fotometr vybavený citlivým fotonásobičem pro registraci světla emitovaného luminiscenčními baktériemi. Dodáváme (Firma Ing. Kříž – EKOTECHNIKA jako autorizovaný prodejce výrobce firmy Hach-Lange GmbH) pro tuto aplikaci poloautomatický LUMIStox 300 – měřící pracoviště. Podrobný popis přístroje a jeho funkcí zde.
Firma Ing. Kříž – EKOTECHNIKA rovněž zajišťuje dodávky indikátorových baktérií v různém provedení dle norem a v různých sestavách balení optimalizovaných na praxi. Měřící systém kompletuje příslušenství jakým je vyhodnocovací software výsledků měření, souprava na polní (rychlý laboratorní) výluh pevného vzorku, soupravy kyvet, tiskárna, počítač apod.

Praktické provedení bioluminiscenčního testu toxicity

Postup závisí na tom, zda je cílem měření zjistit efektivní koncentraci pro určitou hladinu inhibice bioluminiscence nebo jen relativní inhibici vztaženou buď k netoxickému rozpouštědlu (2% NaCl) nebo standardnímu toxikantu (např. síranu zinečnatému). V prvním případě se postupuje zhruba tak, jak je uvedeno v odstavci týkajícím se principu metody. Naměřené hodnoty produkovaného světla se nejprve transformují pomocí tzv. funkce gama, jež je definována jako poměr světla ztraceného v důsledku působení toxikantu a světla zbývajícího. Logaritmus funkce gama se potom vynese v závislosti na logaritmu koncentrace do grafu, z něhož se grafickou interpolací nebo výpočtem zjistí efektivní koncentrace. Toto uspořádání má obvykle smysl jen pro látky, jejichž chemické složení je známé.

U vzorků z reálného životního prostředí se spíše uplatní jednodušší (screeningová) verze BBTT, při níž se proměřuje jen jedna koncentrace testované látky a toxicita se vyjadřuje relativně k účinku referenčního roztoku.
V extrémním případě lze bioluminiscenci měřit jen jednou, až po proběhnutí inkubace s toxikanty. Tato varianta je tedy mimořádně výhodná pro screening početných vzorků z terénu. Je-li IB výsledná intenzita světla naměřená ve zkumavce, kam byl přidán referenční roztok (blank), a I intenzita světla ve zkumavce s toxikantem, je relativní inhibice tohoto toxikantu vzhledem k blanku rovna H = (1 – I / IB) × 100%. Hodnota H může být i záporná, jestliže došlo místo inhibice ke stimulaci. V „normálním“ provedení biotestu by I > IB vedlo k neřešitelné situaci (logaritmus záporného čísla neexistuje). V tomto smyslu tedy má screeningová verze BBTT širší použitelnost než úplná verze poskytující hodnoty efektivních koncentrací.

Možnosti aplikace bioluminiscenčního testu LUMIStox

Včasné stanovení toxické kontaminace, rozhodující úkol při ochraně pitné vody

Hrozby organizovaného terorismu, jsou za poslední léta stále větší. Co se zdálo dříve být jen velmi nepravděpodobným, stává se nyní celosvětově stále větším nebezpečím se kterým je nutno počítat. Teroristický útok z 11. zá ří 2001 v New Yorku a další útoky ze Španělska, Velké Británie a současný denní terorismus v oblasti Blízkého východu tento drastický trend jen potvrzují. Společnost musí na tyto hrozby reagovat. V oblasti ochrany zdraví obyvatelstva je to vedle ochrany před nastraženými náložemi, včasnou spolehlivou a permanentní diagnostikou především pitné vody a ovzduší. Při teroristických akcích mohou být využity vysoce účinné chemické, biologické a jiné látky, aplikované v aerosolech, kontaminující vodní zdroje a rozvody pitné vody, potraviny, běžné předmě ty apod. Právě rychlost toxikologického posouzení je v těchto mimořádných situacích velmi důležitá.

Toxicita půd, řešení ekologické zátěže a akutních havárií

Při testování toxicity vzorků vod a sedimentů je žádaným výsledkem informace, jak tyto vzorky působí na organismy žijící ve vodním ekosystému. Polutanty z půd je možné extrahovat buď vodou nebo organickým rozpouštědlem. Vodný výluh ze vzorku extrahuje pouze biodostupný podíl polutantů a jeho toxicita reprezentuje účinek polutantů, kterému jsou půdní organismy reálně vystaveny. Organický extrakt obsahuje všechny polutanty přítomné ve vzorku, tedy i ty, které byly imobilizovány vazbou na půdní částice a organismům nebyly dostupné.
Systém LUMIStox umožňuje rychlé plošné skreeningové posouzení kontaminace rozsáhlých území a současně, pro kritické oblasti, podrobné posouzení vzorku ředícími řadami a stanovením příslušných hodnot efektivních koncentrací (EC 20, EC 50 a p.)

Toxicita chemických látek a odpadů, s BBTT efektivní rutina toxikologické laboratoře

Současná legislativa ukládá posuzovat řadu látek z hlediska bezpečnosti životního prostředí. Jedním ze standardně sledovaných parametrů je toxicita s upřesněnými definicemi jako ekotoxicita, akutní toxicita, apod. Pro tuto praxi je v Evropě a v jistém rozsahu i u nás běžně využíván BBTT.
Využíváním výsledků testů ekotoxicity ve spojení s dalšími parametry lze například přesněji stanovit realné podmínky pro sanaci i konečné hodnoty sanačních limitů a tím dosáhnout úspor na provedení sanace, které mohou dosahovat desítek miliónů korun ročně.

Věda a výzkum

Využití bakteriální bioluminiscenšního testu má pro vědeckou činnost nezastupitelnou hodnotu. Test je využíván při posuzování povrchových, průmyslových a odpadních vod, nebo pórové vody při zkoumání sedimentů. Ve významném sevročeském výzkumném ústavu paracoval LUMIStox při analýzách imisí tohoto průmyslového hnědouhelného regionu. Luminometr tedy lze využít při testování kvality ovzduší, půd (vodný nebo org. extrakt) apod.
S využitím BBTT byla zpracována odbornými pracovišti v ČR řada vědeckých prací.